熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)指南
一、基本步驟：
1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對(duì)；
2、引物、探針的設(shè)計(jì)；
3、引物探針的合成；
4、反應(yīng)體系的配制；
5、反應(yīng)條件的設(shè)定；
6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化；
7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；
8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備；
二、技術(shù)關(guān)鍵：
1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對(duì)；
從
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個(gè)序列后，直接“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“import”，打開后“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后要對(duì)所有的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，“add” 或“add all”，然后“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時(shí)要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。有時(shí)因?yàn)閰?shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組（contig），若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認(rèn)設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個(gè)組，“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在所分析的序列在一個(gè)“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時(shí)因此個(gè)別序列原因，會(huì)出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對(duì)“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個(gè)序列的真實(shí)且排列同源性的排列。然后，“save”保存即可。分析時(shí)，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對(duì)于彌散性的紅色是不可用的。
2、 引物和探針設(shè)計(jì)
2.1引物設(shè)計(jì)
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
² 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
² 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：
sybr green I技術(shù)對(duì)片段長(zhǎng)度沒有特殊要求；
Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp；
² 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；
² 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
² 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
² 引物之間的TM相差避免超過2℃；
² 引物的3’端避免使用堿基A；
² 引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。
² 為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)能跨兩個(gè)外顯子。
2.2 Taqman 探針設(shè)計(jì) 一般設(shè)計(jì)原則：
² 探針位置盡可能地靠近上游引物；
² 探針長(zhǎng)度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
² 探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。
² 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。
² 為確保引物探針的特異性，將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。（
www.ncbi.nlm.nih/blast）
2.3 Taqman MGB 探針設(shè)計(jì)介紹
MGB探針的優(yōu)點(diǎn)：
² MGB探針較短（14-20bp），更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。
² 短片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。
² MGB探針的設(shè)計(jì)原則
² 探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)。
² 用primerexpress軟件評(píng)價(jià)Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。
² 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長(zhǎng)度不少于13bp。
² 盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個(gè)或4個(gè)以上的G重復(fù)出現(xiàn)。
² 原則上MGB探針只要有一個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針將不會(huì)與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)）。因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號(hào)檢測(cè)將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動(dòng)，但突變位點(diǎn)至少在離3’端2個(gè)堿基的前方（即必須確保探針的后兩個(gè)堿基是的保守），以進(jìn)行SNP檢測(cè)。反過來，若要進(jìn)行同類檢測(cè)，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個(gè)bp,探針仍不保守。有幾個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測(cè)到突變。
2.4 實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇：
多重實(shí)時(shí)PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測(cè)時(shí)可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。
多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時(shí)為Taqman 探針、或同時(shí)為MGB探針、或同時(shí)為Beacon 探針。
在多重PCR中，多重PCR的各個(gè)引物之間相互干擾和各個(gè)探針之間相互干擾分析:
設(shè)計(jì)好各對(duì)引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重探針后，在“report”菜單下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對(duì)引物有多少個(gè)dimer，并對(duì)此對(duì)引物用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)（通常給出差的dG值，理論上是dG值越大越好）。
3、影響PCR及熒光PCR 的其他因素
引物的設(shè)計(jì)和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計(jì)意味著的失敗。但是，好的設(shè)計(jì)并不等于好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。
3.1 引物退火溫度
引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm可信的方法是近鄰分析法。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過5℃，就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
3.2 引物濃度
引物的濃度會(huì)影響特異性。佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測(cè)量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計(jì)算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。
一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個(gè)堿基長(zhǎng)的引物，1個(gè)O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計(jì)算出一定的工作濃度下，引物的加水量。
濃度（μM）＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）
舉例：計(jì)算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測(cè)吸光度為0.2。計(jì)算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得：
濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM
3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長(zhǎng)序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個(gè)循環(huán)過程，在每個(gè)堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個(gè)循環(huán)都可能失敗。較長(zhǎng)的引物，尤其是大于50個(gè)堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽螅赡苄枰兓?/div>
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶引物，使其終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）多可以保存2個(gè)月。
探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時(shí)間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。
由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。
3.4 熱啟動(dòng)
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受*，如定點(diǎn)突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能抑制酶的活性，因此并不能消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動(dòng)方法十分煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
Transitor® Hot Start Taq酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR來說可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會(huì)產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會(huì)被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會(huì)被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會(huì)被釋放到反應(yīng)中，從而恢復(fù)聚合酶活性。
3.5鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如DNA聚合酶的活性，這會(huì)影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會(huì)影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。佳的鎂離子濃度對(duì)于不同的引物對(duì)和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對(duì)鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。
3.6 模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會(huì)抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時(shí)就會(huì)抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。
3.7 模板濃度
起始模板的量對(duì)于獲得高產(chǎn)量很重要。對(duì)大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個(gè)起始目的分子就足以觀測(cè)到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當(dāng)于3×104到3×105個(gè)分子，足以檢測(cè)到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級(jí)的。對(duì)于一般的檢測(cè)樣品，10－100ng的量就足夠檢測(cè)了。當(dāng)然對(duì)模板做一個(gè)梯度稀釋，對(duì)于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。
表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例
| 基因組 DNA | Size（bp）* | Target Molecules/µg of Genomic DNA | Amount of DNA（µg） for -10^5 Molecules |
| E. coli | 4.7×10^6 | 1.8×10^8 | 0.001 |
| Saccharomyces cerevisiae | 2.0×10^7 | 4.5×10^7 | 0.01 |
| Arabidopsis thaliana | 7.0×10^7 | 1.3×10^7 | 0.01 |
| Drosophila melanogaster | 1.6×10^8 | 6.6×10^5 | 0.5 |
| Homo sapiens | 2.8×10^9 | 3.2×10^5 | 1.0 |
| Xenopus laevis | 2.9×10^9 | 3.1×10^5 | 1.0 |
| 1.0Mus musculus | 3.3×10^9 | 2.7×10^5 | 1.0 |
| Zea mays | 1.5×10^10 | 6.0×10^4 | 2.0 |
| pUC 18 plasmid DNA | 2.69×10^3 | 3.4×10^11 | 1×10^（-6） |
3.8 防止殘余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源（非殘余污染）。
可以在PCR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?duì)照檢測(cè)污染。
使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。
一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感，所有可以在PCR前對(duì)新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。
4、高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系
影響PCR的因素如此之多，您有時(shí)很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳。降低實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定因素是使用可靠的產(chǎn)品。
使用、性能可靠的熱啟動(dòng)酶、的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，大程度的降低了反應(yīng)變量，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進(jìn)行以下步驟的準(zhǔn)備：設(shè)計(jì)引物和探針、合成引物和探針、正確儲(chǔ)藏、得到高質(zhì)量的模板，隨后，您僅需要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）同競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的定量PCR體系相比提供了更的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時(shí)可以靈活地選擇您所喜歡的擴(kuò)增條件，檢測(cè)方法和設(shè)備。
實(shí)時(shí)定量PCR是快速增長(zhǎng)的PCR方法，它可以、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）是一種方便使用的反應(yīng)混合液，為定量分析進(jìn)行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實(shí)時(shí)qPCR所需的特異性和靈活性。
高產(chǎn)量和特異性的擴(kuò)增
FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）提供了強(qiáng)大的PCR擴(kuò)增，可以使用多個(gè)模板組。所使用的Taq DNA聚合酶具有熱啟動(dòng)特性。這極大地降低和消除了錯(cuò)誤配對(duì)和非特異性擴(kuò)增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴(kuò)增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更可靠。
在產(chǎn)量和靈敏度方面，Quantitative PCR MASTER Mix-UDG（hot start）的靈敏度（閾循環(huán)）。您可以更地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)線性劑量反應(yīng)。
高度靈活性
除了靈敏度和特異性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析設(shè)置，檢測(cè)方法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：
對(duì)擴(kuò)增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。
可以更靈活的進(jìn)行普通PCR和熒光PCR。
可以在多種設(shè)備上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。
可以利用多種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)，包括TaqMan®探針和Molecular Beacon，您不必局限于特定的試劑盒。
5、反應(yīng)體系配制：
ð A2010A0101試劑盒：（探針體系）
FQ-PCR MasterMix-UNG混合物（2X） 25ul（終濃度為1×）；
上游引物（終濃度為50~900nM），下游引物（終濃度為50~900nM）；
探針（終濃度為200nM）；
待檢樣品 5ul（終濃度為10~100ng）；
無菌去離子水 補(bǔ)足，使總體積達(dá)到 50ul 。
ð A2010A0106 試劑盒:
反應(yīng)體系終濃度：
1-2U的hot start Taq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer（A2010A0106）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板,反應(yīng)總體積通常為20－50ul
ð 自配熱啟動(dòng)熒光－UNG 體系：
1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0104）；0.2-1U的UNG酶（A2010A0107）、0.2－0.4mM的d（A,C,G）TPs、0.3-0.6mMdUTP（A2010A0108）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應(yīng)總體積通常為20－50ul
6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化；
使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start），大程度降低了需要優(yōu)化的參數(shù)。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結(jié)果。對(duì)于特殊結(jié)構(gòu)的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。
使用通用PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，可以適合更多的反應(yīng)體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測(cè)，適用于合成質(zhì)粒的PCR，同時(shí)也適用于熒光PCR，范圍更寬。
采用成套的hot start Taq酶，您需要對(duì)酶量、鎂離子濃度、UNG濃度、dUTP濃度、引物濃度、退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化（參照3：影響PCR及熒光PCR 的其他因素）進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的指標(biāo)越多，實(shí)驗(yàn)的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復(fù)性。注意：同樣可參照的QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事項(xiàng)。
7、適用的熒光儀器、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；
目前市場(chǎng)上有許多種實(shí)時(shí)PCR儀：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 （Applied Biosystems）；MX4000 （Stratagene）；iCycler （Bio-Rad）；Smartcycler（Cepheid）；Robocycler （MJ Research）；Lightcycler （Roche）；ROTORGENE（CORBERT） ；杭州博日（Linegene）。
不同的儀器使用方法有所區(qū)別，但都具備對(duì)Taqman 探針和sybgreen 染料法的檢測(cè)波長(zhǎng)和檢測(cè)能力。QPCR MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均適合在這些儀器上進(jìn)行使用。
為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對(duì)照和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品都平行做2個(gè)復(fù)孔。
基線或閥值的設(shè)定 通常是以10－15個(gè)循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對(duì)照熒光值的高點(diǎn)作為基線。
8、疑難解答
| 問 題 | 可能原因 | 建議解決方法 |
| 定量PCR 無擴(kuò)增產(chǎn)量或很少的擴(kuò)增產(chǎn)量 | DNA模板質(zhì)量不好，含有抑制劑 | 提高模板質(zhì)量，諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類的試劑會(huì)抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA |
| PCR引物設(shè)計(jì)較差 | 避免在引物3'端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì)Tm類似的引物。 |
| 探針設(shè)計(jì)較差 | 對(duì)探針序列進(jìn)行blast比對(duì)，設(shè)計(jì)符合要求的探針 |
| PCR引物合成較差 | 用普通電泳法，看引物的設(shè)計(jì)和合成質(zhì)量，是否有目的條帶出現(xiàn)。 |
| 熒光探針無功能 | 確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase處理TaqMan探針，校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)。
必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。 |
| 模板濃度太低 | 使用10^4拷貝的靶序列，以在25到30個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)。 |
| 鎂離子濃度太低 | 從3mM到5mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的佳鎂離子濃度。FQ-PCR MasterMix-UNG 試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度。 |
| 引物濃度太低 | 佳引物濃度介于0.1μM到0.5μM之間。為了確定引物濃度，在260nm測(cè)量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。（見公式1） |
| 選擇酶進(jìn)行擴(kuò)增 | 選擇hot start Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，可提高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素 |
| 退火溫度太高 | 使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5℃。因?yàn)檫@些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實(shí)際會(huì)高些或低些。 |
| 反應(yīng)物中有不明物干擾 | 在各個(gè)反應(yīng)物中存在不明物質(zhì)對(duì)PCR進(jìn)行干擾，對(duì)任何實(shí)驗(yàn)樣品或試劑，均應(yīng)采用無菌無酶無熱源的離心管進(jìn)行試劑的分裝和使用。 |
| 定量PCR陽性對(duì)照無擴(kuò)增曲線（針對(duì)：已經(jīng)優(yōu)化好的體系） | 引物、探針設(shè)計(jì)合格；原來合成質(zhì)量已經(jīng)驗(yàn)證。需確認(rèn)： | 反應(yīng)成分是否漏加；確定反應(yīng)條件是否合適； 正常標(biāo)本是否能擴(kuò)增來判斷是對(duì)照的問題還是體系的問題； 確認(rèn)體系：1、引物是否降解（看擴(kuò)增產(chǎn)物是否可電泳出）來判斷引物和酶功能；2、探針是否降解（用DNase處理TaqMan探針，校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)）。 |
| 儀器是否正常工作 | |
| 定量PCR陰性對(duì)照一直有擴(kuò)增曲線 | 模板或PCR殘余污染 | 隔離污染來源，更換試劑。 使用UNG/dUTP防污染系統(tǒng)。
使用的精致移液器。 在無DNA區(qū)域準(zhǔn)備反應(yīng)，使用抗氣溶膠的吸頭。 |
| 體系有問題 | 酶濃度不對(duì)，Mg離子濃度不對(duì) |
| 定量PCR（染料法）出現(xiàn)非特異信號(hào) | 引物二聚體多 | 檢查引物設(shè)計(jì)和合成環(huán)節(jié)，必要時(shí)更改引物 |
| 更換熱啟動(dòng)酶 | 熱啟動(dòng)酶能增加反應(yīng)的特異性，提高靈敏度 |
| 設(shè)定檢測(cè)信號(hào)時(shí)的溫度 | 在更高的溫度下檢測(cè)熒光信號(hào)（此時(shí)引物二聚體已經(jīng)解鏈） |
| 定量RT-PCR
無擴(kuò)增產(chǎn)量
相對(duì)熒光信號(hào)小于等于背景或沒有模板對(duì)照 | 無cDNA合成 | |
| cDNA合成溫度太高 | 降低保溫溫度 |
| 反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物被二級(jí)結(jié)構(gòu)封閉 | 提高保溫溫度。重新設(shè)計(jì)引物 |
| RNA被損害或降解 | 必要的話更換RNA |
| RNAse污染 | 維持無菌條件；加入RNase抑制劑 |
| 熒光探針無功能 | 確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase處理TaqMan探針，校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)。
必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。 |
| 靈敏度低
須在比預(yù)期更高的循環(huán)中檢出產(chǎn)物（Ct滯后） | 初始模板RNA不充分 | 增加模板RNA的濃度；使用10ng-1µg的總RNA |
| RNA被損害和降解 | 必要的話更換RNA |
| RNAse污染 | 維持無菌條件；加入RNase抑制劑 |
| 無效的cDNA | 通過增加70％乙醇清洗的次數(shù)來去除制備RNA過程中的抑制劑 |
| 無效的PCR擴(kuò)增 | 注意：反轉(zhuǎn)錄的抑制劑包括SDS、EDTA、胍鹽、甲酰胺、磷酸鈉和亞精胺。
調(diào)整cDNA合成溫度或引物設(shè)計(jì) |
| 檢測(cè)使用儀器 | 擴(kuò)增儀溫度檢查和熒光儀器溫度和信號(hào)檢查，是整體滯后還是個(gè)別孔滯后 |
| PCR忠實(shí)性：PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤 | 采用熒光探針法 | 增加結(jié)果特異性和產(chǎn)物的忠實(shí)性 |
| 循環(huán)數(shù)太多 | 降低循環(huán)數(shù)。 |
| 四種dNTP的濃度不同 | 制備新的dNTP混合物，四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。 |
其他問題：
1）、文獻(xiàn)上找到的引物和探針序列能否直接使用？
通常國(guó)外的文獻(xiàn)可信度比較高，可直接使用；但為了保險(xiǎn)起見，用blast對(duì)引物探針的序列進(jìn)行必要的驗(yàn)證；或者再進(jìn)一步用primer軟件對(duì)引物探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)和退火溫度進(jìn)行分析，這樣更有利于您對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的把握。
2）、在實(shí)驗(yàn)之前要進(jìn)行哪些準(zhǔn)備工作？
首先要不加探針做常規(guī)的PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證引物是否工作、模板是否降解、模板純度是否合適，可以采用《通用PCR Master Mix 試劑盒》來縮短該過程。
3）、標(biāo)本的采集和處理應(yīng)該注意什么問題？
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和目的，有針對(duì)性采集病灶部位的標(biāo)本；采集好的標(biāo)本，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量，用凍存管分成幾小份，放在－80℃保存，以免反復(fù)凍融；標(biāo)本通常分成3類，如細(xì)胞組織、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血現(xiàn)象的發(fā)生，否則會(huì)影響PCR的擴(kuò)增；如果是全血，不用EDTA作為抗凝劑，選用檸檬酸作為抗凝劑，否則會(huì)影響PCR的擴(kuò)增；如果是組織，用蛋白酶K消化；如果是提RNA的標(biāo)本，更應(yīng)該防止反復(fù)凍融和保持標(biāo)本的新鮮。
4）、在做熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意些什么呢？
見產(chǎn)品操作注意事項(xiàng)。
5）、如果出現(xiàn)污染該怎么辦？
以替換法確定污染從何而來，對(duì)癥下藥，值得注意的是，因熒光定量PCR的敏感度，從防止污染的角度出發(fā)，在體系中加有dUTP，一旦出現(xiàn)污染現(xiàn)象，可以用UNG酶消除；同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室分成4個(gè)區(qū)，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。
